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技術文章

色譜柱的選擇

閱讀次數:1675    發布時間:2016/2/28 16:28:17

現代高效液相色譜中,分離效果好壞很大程度上取決于對色譜填料的選擇。但是色譜填料的選擇范圍很寬,要做合適的選擇,必須對此有一定的認識和了解。
 
1、正相色譜
正相色譜用的固定相通常為硅膠(Silica),以及其他具有極性官能團,如胺基團
(NH2,APS)和氰基團(CN,CPS)的鍵合相填料。
  
由于硅膠表面的硅羥基(SiOH)或其他團的極性較強,因此,分離的次序是依據樣品
中的各組份的極性大小,即極性強弱的組份最先被沖洗出色譜柱。
正相色譜使用的流動相極性相對比固定相低,如:正乙烷(Hexane),氯仿
(Chloroform),二氯甲烷(Methylene  Chloride)等。

 

2、反相色譜
反相色譜填料常是以硅膠為基礎,表面鍵合有極性相對較弱的官能團的鍵合相。
反相色譜所使用的流動相極性較強,通常為水,緩沖液與甲醇,已腈等混合物。
樣品流出色譜柱的順序是極性較強組合最先被沖出,而極性弱的組份會在色譜柱上有
更強的保留。
常用的反相填料有C18(ODS)、C8(MOS)、C4(B)、C6H5(Phenyl)等。
 
二、聚合物填料
聚合物調料多為聚苯乙烯-二乙烯基苯或聚甲基丙酸酯等,其主要優點是在PH值為1~
14均可使用。
相對與硅膠基質的C18填料,這類填料具有更強的疏水性;大孔的聚合物填料對蛋白
質等樣品的分離非常有效。
現在的聚合物填料的缺點是相對硅膠基質填料,色譜柱柱效較低。
 
三、其他無機填料
其它HPLC的無機填料色譜柱也已經商品化。由于其特殊的性質,一般僅限于特殊的
用途。如石墨化碳也用于正逐漸成為反相色譜填料。這種填料的分離不同與硅膠基質烷基
鍵合相,石墨化碳的表面即是保留的基礎,不再需其它的表面改性,該柱填料一般比烷基
鍵合硅膠或多孔聚合物填料的保留能力更強,石墨化碳可用于分離某些幾何導構體,又由
于HPLC流動相中不會被溶解,這類柱可在任何PH與溫度下使用。氧化鋁也可用于HPLC,
氧化鋁微粒剛性強,可制成穩定的色譜柱柱床,其優點是可在PH高達12的流動相中使用。
但由于氧化鋁與堿性化合物作用也很強,應用范圍受到一定的限制,所以未能廣泛應用,
新型氧化鋯填料也可用于HPLC,商品化的僅有聚合物涂層的多孔氧化鋯微球色譜柱,應
用PH范圍1~14,溫度可達100℃。由于氧化鋯填料幾年才開始研究,加之面臨的實驗難
度,其重要用途與優勢尚在進行中。
 
四、怎樣選擇填料粒度
 目前,商品化的色譜料粒度從1um到超過30um均有銷售,而目前分析分離主要用3um、
5um和10um填料,填料的粒度主要影響填充柱的兩個參數,即柱效和背壓。粒度越小,填
充柱的柱效越高;小于3um的填料應用,在相同選擇性條件下,提高柱效可提高分離度,
但不是唯一的因素。如果固定相選擇是正確,但是分離度不夠,那么選擇更小粒度的填料
是很有用的,3um填料填充柱的柱數比相同條件下的5um填料的柱效提高近30%;然而,
3um的色相譜的背壓卻是5um的2倍。與此同時,柱效提高意味著在相同條件下可以選擇更
短的色譜柱,以縮短分析時間,另外,可以采用低粘度的溶劑做流動相或增加色譜柱的使
用溫度,比如用乙腈代替甲醇,以降低色譜柱的壓力。
 
一、如何保證良好的柱性能與柱壽命
◆ 認證閱讀色譜柱使用說明書;
◆ 使用填充良好的色譜柱;
◆ 盡量減少壓力波動,避免機械及熱沖擊;
◆ 使用保護柱及在線過濾器;
◆ 經常以強溶劑沖洗色譜柱;
◆ 充分過濾樣品及流動相,盡量避免雜質微粒與強保留成分;
◆ 用穩定的固定相(C18最穩定);
◆ 在中等PH值操作(6~8),用有機緩沖溶液;
◆ 色譜柱使用溫度最好小于40℃;
◆ 硅膠基質的的色譜柱,應保持流動相的PH值范圍在3.0~8.0;
◆ 在水流動相與緩沖溶液中加200ppm的疊氮鈉;
◆ 流動相中含有緩沖溶液,應注意應95∶5的水及有機溶劑過渡,有機溶劑不能低于5%;
◆ 過夜或貯存時,沖洗掉鹽和緩沖液,用純有機溶劑流動相保存(乙晴最好)。

原創作者:杭州昕儀科技有限公司

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